①凱氏定氮法
原理:蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱,蛋白氮轉化為銨鹽,在強堿性條件下將氨蒸出,用加有指示劑的硼酸吸收,最后用標準酸滴定硼酸,通過(guò)標準酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。
②雙縮脲法
原理:尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲,在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡(luò )合物。蛋白質(zhì)中的肽鍵實(shí)際上就是酰胺鍵,故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲(biuret)反應,產(chǎn)生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質(zhì)含量。
缺點(diǎn):靈敏度低,樣品必須可溶,在大量糖類(lèi)共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg),且會(huì )受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾,但 準確度 較高,不受蛋白質(zhì)的種類(lèi)影響。
?、跢olin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸,所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑(堿性銅試劑),試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應生成藍色物質(zhì),600nm比色測定蛋白質(zhì)含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg),但較麻煩,也會(huì )受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合,要特別注意均勻澈底,否則會(huì )有大誤差。
?、茏贤夥?/span>
280nm光吸收法:利用Tyr在280nm在吸收進(jìn)行測定。
280nm-260nm的吸收差法:若樣品液中有少量核酸共存按下式計算:
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標)
⑤色素結合法(Bradford 法)
直接測定法:利用蛋白質(zhì)與色素分子(Coomassie Brilliant Blue G-250)結合物的光吸收用分光光度法進(jìn)行測定。
考馬斯亮蘭(CBG)染色法測定蛋白質(zhì)含量。CBG 有點(diǎn)像指示劑,會(huì )在不同的酸堿度下變色;在酸性下是茶色,在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候,因為蛋白質(zhì)會(huì )提供 CBG一個(gè)較為中性的環(huán)境,因此會(huì )變成藍色。當樣本中的蛋白質(zhì)越多,吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多,藍色也會(huì )增強。因此,藍色的呈色強度,是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。
間接測定法:蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計測定未結合的色素,以每克樣品結合色素的量來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的多少。
⑥BCA法
BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4’-二羧-2,2’-二喹啉)法與Lowry法相似,主要差別在堿性溶液中,蛋白質(zhì)使Cu2+轉變Cu+后,進(jìn)一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產(chǎn)生深紫色,在波長(cháng)562 nm有強的吸收。
它的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩定,因此BCA與堿性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度,較不受干擾,但會(huì )受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠,呈洋紅色,具有高電子密度,并能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉變?yōu)樗{色,顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系,可用于蛋白質(zhì)的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團,如 過(guò)氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團,可測 403 nm 波長(cháng)的吸光來(lái)定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘),則可追蹤該金屬。